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组卵白印迹

宣布者:艾美捷科技    宣布时候:2021-05-13     
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1、每一个泳道筹办 0.5 μg 小牛胸腺或酸提取的组卵白,浓缩于插手了 100 mM DTT 的 1X LDS 样品缓冲液中。95 °C 煮样5 分钟,离心。


(请注重,细胞裂解物的上样量须要凭经历肯定。


2、制备 10% Bis-Tris 凝胶,厚度为 1.0 mm。为了更好的分手阐发组卵白,倡议利用较高百分比的凝胶 (15%)。


3、组卵白样品上样,包含预染的卵白规范品。于 200V 下在 MES SDS 电泳缓冲液中跑胶 35 分钟。


在卵白份子量较小时,染料前沿最好不要完整跑出凝胶。


4、对转膜,请参考转膜仪器供给的尝试计划,差别的转膜方式(即半干或湿法)会有所差别。转膜时候介于 30 分钟到 90 分钟之间;咱们利用 1X 转膜缓冲液/20% 甲醇在 30V 下转 70 分钟。


倡议利用孔径为 0.2 mm 的NC膜使组卵白保留在膜上。


5、利用丽春红染色考证组卵白的胜利转膜和相称的上样量。利用 dH2O 洗去染色。


6、在室温 (RT) 下利用 5% BSA/0.1% TBST (50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 150mM NaCl, 0.1% Tween 20) 封锁 1 小时。


7、若有须要,将膜切成条带,并根据产物申明书保举浓缩度在封锁缓冲液 (5% BSA/0.1% TBST) 中浓缩一抗。对封锁肽,根据请求插手 (1 μg/mL),置于摇床上,室温孵育 20 分钟。一抗室温孵育 1.5 小时或 4 °C 留宿。


8、利用 0.1% TBST 中简略洗膜,随后利用不异的缓冲液洗濯两次,每次 5 分钟,接着再洗濯两次,每次 10 分钟。


9、在室温下孵育二抗 1 小时 [比方 ab6721:山羊多克隆抗兔 IgG H&L (HRP)],根据倡议在 1% BSA/0.1% TBST 中停止浓缩。


10、0.1% TBST 洗膜两次,每次 5 分钟,再洗濯两次,每次 10 分钟。


11、检测方式示环境而定,ECL、ECF 或红外荧光检测。举个例子:在膜上加 ECL 试剂室温 3 分钟,在差别暴光时候下捕获WB图象:10 秒、30 秒、1 分钟、2 分钟、3 分钟、4 分钟和 5 分钟。


利用组卵白抗系统列胜利停止WB的主要技能。

利用高百分比的凝胶。

利用孔径为 0.2 ?m 的NC膜。

封锁液利用高品德 BSA,不要利用 Marvel 等惯例奶粉。

务必利用内参对比抗体!

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